El largo y sinuoso camino: en marcha

Jan 26, 2024

La accesibilidad a la tecnología de escritura de ADN está creciendo gracias a la comercialización de estas técnicas a través de servicios que van desde impresoras de ADN de sobremesa hasta síntesis personalizadas.

Crédito: CIPhotos/Stock/Getty Images Plus

El estado de la síntesis del ADN es un poco como el viaje de la humanidad a la luna: sólo porque se haya logrado algo antes no significa que debamos dejar de descubrir cómo hacerlo mejor”.

Así es como Harold P. de Vladar, director ejecutivo y fundador del proveedor de servicios de ADN sintético largo Ribbon Biolabs, ve la gran oportunidad en el espacio de la síntesis de ADN. de Vladar dice que la síntesis de ADN equivalente al alunizaje del Apolo 11 fue el trabajo histórico de Craig Venter al ensamblar el bacteriófago ΦX174 de 5386 pb a partir de hebras individuales cortas de ADN sintético disponible comercialmente conocido como oligonucleótidos.1 Venter y su equipo en el J. Craig El Instituto Venter construyó el genoma ΦX174 utilizando una adaptación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) llamada ensamblaje del ciclo de la polimerasa2 en 2002-2003, justo después de la secuenciación del genoma humano a principios de la década de 2000.

Este problema persistió hasta hace unos años. “Cuando todavía era investigador, me enfrenté al problema de producir ADN largo al querer sintetizar una biblioteca de genomas de fagos pequeños, de alrededor de 4000 pb, y ese era un proyecto imposible. Quería unas 250 secuencias y esto era inalcanzable”, dijo de Vladar.

Hace unos 10 años, de Vladar vio que una empresa llamada Twist Bioscience empezaba a aparecer en las noticias. Se dio cuenta de que la gente todavía estaba interesada en sintetizar ADN largo. “Superficialmente, la síntesis de ADN parecía resuelta, pero cuando empiezas a analizar los detalles, cómo ha disminuido el costo por base para la secuenciación, etc., te das cuenta de que esto estaba lejos de estar resuelto” (Cuadro 1).

El costo de la secuenciación se ha desplomado durante los últimos 10 a 15 años a un ritmo que ha superado la ley de Moore. El costo de una secuencia del genoma humano disminuyó de un millón de dólares estimado en 2007 a 1000 dólares en 2014, y hoy se acerca a los 100 dólares, y la serie Illumina NovaSeq X y Ultima Genomics UG100 reclaman costos de 200 y 100 dólares por genoma, respectivamente. Pero la asequibilidad de la síntesis de ADN personalizada no ha seguido el ritmo y el costo sigue siendo relativamente alto. Durante los últimos años, ha habido una tendencia general a que los costos de síntesis de genes caigan a 0,01 dólares por pb, en comparación con menos de 1 o 2 dólares por Gigabase que ofrecen las últimas herramientas de secuenciación de próxima generación.7

En 2018, de Vladar lanzó Ribbon Biolabs en Viena, Austria. La empresa de síntesis de ADN puede construir de manera confiable fragmentos de 1 kb en un día, que pueden ensamblarse en moléculas más grandes de 10 a 20 kb. Para hacerlo, Ribbon procesa algorítmicamente una secuencia en partes más pequeñas que se clasifican en un árbol de decisión para identificar la mejor combinación de oligos de 10 y 12 meros (de su biobanco de casi 80.000 oligos) para el ensamblaje automatizado. El verdadero tiempo de respuesta, incluida la verificación y entrega basada en secuencias, para la pequeña empresa (con solo unas pocas docenas de empleados) es de aproximadamente 3 días. El objetivo de de Vladar y Ribbon Biolabs es escalar la síntesis de genes desde el enfoque de biblioteca a 1000 kb por día.

Al mejorar las enzimas y los estándares de ensamblaje, se ha mejorado la precisión y la cantidad de moléculas de ADN que se pueden combinar en un solo paso. En la última década, se han desarrollado una gran cantidad de nuevos y potentes métodos de ensamblaje de ADN, incluido el ensamblaje Gibson3. Estos métodos de ensamblaje se han aplicado en la construcción de un genoma bacteriano mínimo4 y cromosomas de levadura sintéticos.5

Los enfoques de ensamblaje para la síntesis de ADN tienen varios inconvenientes: pueden verse comprometidos por las impurezas de los oligonucleótidos sintéticos, la dependencia del método de la confirmación de la secuencia de un clon individual y la dependencia de las enzimas de PCR de corrección de pruebas de alta fidelidad, que deben usarse para copiar lo construido. genes para prevenir mutaciones durante la amplificación.

El enfoque escalonado de Ribbon Biolabs está limitado por el tamaño físico de las moléculas sintetizadas. "El ADN de 20 a 40 kb es una molécula realmente compleja", dijo de Vladar. “Las reacciones ya no son tan eficientes. Pero eso ni siquiera es lo peor del problema: las moléculas de ADN más largas se rompen debido a la pura fuerza. La asamblea en sí no es el problema; es la manipulación de las moléculas de ADN. Es un problema que también estamos intentando resolver y tenemos algunas ideas en I+D. Pero no imprimirá sólo 30 kb con solo presionar un botón”.

Además, no todo el mundo está de acuerdo en que el ensamblaje sea síntesis de ADN. “Cuando hablamos de síntesis de ADN, tenemos que ser un poco cautelosos porque algunas personas hablan de síntesis de oligonucleótidos y otras hablan de ensamblaje de genes”, dijo Sylvain Gariel, cofundador y director de operaciones de DNA Script, una empresa que sintetiza químicamente ADN.

Desde que se resolvió por primera vez la estructura del ADN hace 70 años, se han logrado hitos sustanciales que allanaron el camino para la industria de la síntesis de ADN. Durante los últimos 40 años, los científicos han tomado medidas constantes para descubrir la química detrás de la creación paso a paso del ADN, nucleótido a nucleótido. Se desarrollaron métodos químicos para proporcionar de manera confiable cadenas cortas de ADN, generalmente <200 nucleótidos (oligonucleótidos). Estos métodos se diseñaron para funcionar mejor con sintetizadores automáticos, que ahora son necesarios para la ingeniería y secuenciación genética.

A continuación, los científicos idearon métodos para crear ADN que sea más largo y complejo que los oligonucleótidos mediante el uso de enzimas con o sin plantillas de ADN. Por ejemplo, la tecnología básica de DNA Script es la síntesis enzimática de oligonucleótidos independiente de la plantilla. Las empresas han convertido estos métodos de síntesis química en productos y servicios, como impresoras de ADN de mesa y síntesis personalizadas, que hacen posible la síntesis de ADN para personas que no son expertas.

El 9 de marzo de 2023, Ansa Biotechnologies, Inc. informó que habían elaborado con éxito el oligonucleótido de ADN más largo del mundo en una sola síntesis. La secuencia de 1005 bases codifica una parte clave de un vector de virus adenoasociado utilizado para desarrollar terapia génica. Tiene características complejas, como estructuras secundarias fuertes y un alto contenido de GC, que hacen que sea muy difícil de elaborar con métodos tradicionales que requieren la unión de oligonucleótidos más cortos.

Como ingeniero de metabolitos, Gariel estaba limitado por la adquisición de construcciones de ADN. Tuvo que esperar semanas o incluso meses para obtener largos tramos de ADN de decenas o incluso cientos de genes. En DNA Script, Gariel está avanzando hacia la comercialización de un dispositivo de síntesis de ADN de mesa llamado Syntax para evitar este cuello de botella (Figura 1).

"Nuestro objetivo final en el mercado era que, si podía hacerlo en mi banco, de repente eliminaría todas las veces que el proveedor de servicios requiere", explicó Gariel. “No le cedo el control a un proveedor de servicios mientras tenga un instrumento y los reactivos que necesito para ejecutarlo. Puedo hacerlo en la mesa de trabajo sin ningún requisito de infraestructura específico más que un espacio de biología molecular y un enchufe eléctrico”.

El instrumento Syntax es un sintetizador de ADN de sobremesa de tamaño similar al secuenciador HiSeq de Illumina. Este sintetizador puede generar oligonucleótidos de 60 pb en forma pura para uso inmediato en 6 h.

Para hacer que la síntesis de ADN sea más segura y accesible, DNA Script ha abordado el peligro que representa la química de la fosforamidita (Cuadro 2), tanto para el usuario como para el medio ambiente. Gariel señala que es por eso que esta química conlleva fuertes limitaciones en términos de infraestructura y mano de obra dedicada.

Los avances en la síntesis en fase sólida (la síntesis de compuestos químicos mediante la cual la molécula reactiva se une químicamente a un material insoluble y los reactivos se agregan en la fase de solución) inspiraron el desarrollo innovador de la química de la fosforamidita para la síntesis de ADN en la década de 1980 por Marvin H. Caruthers. de la Universidad de Colorado Boulder.8 En la década de 1980, el primer sintetizador de ADN automatizado fue el resultado de una colaboración con Caruthers, y se basó en el trabajo de Caruthers que dilucidaba la química de la síntesis de oligonucleótidos de fosforamidita. Applied Biosystems utilizó este método para fabricar el primer sintetizador de ADN automatizado. Esto facilitó que las personas obtuvieran oligonucleótidos sintéticos. Pero el método de la fosforamidita para producir ADN tiene algunos problemas, como la fosforamidita que no se mantiene estable en el laboratorio, la necesidad de utilizar muchos disolventes orgánicos y la incapacidad de producir secuencias polirrepetidas.

Sintetizar, procesar y purificar oligonucleótidos es un proceso que requiere mucha mano de obra y que todavía realizan principalmente los proveedores de servicios. Por lo tanto, las capacidades de síntesis se han centralizado dentro de los fabricantes de reactivos especializados. Empresas líderes como Agilent Technologies, GenScript, Integrated DNA Technologies, ThermoFisher, TriLink, Dharmacon, Twist Bioscience y otras fabrican ADN (y ARN) personalizado bajo demanda en una variedad de formatos. Existe una gama de instrumentos para los usuarios que desean reducir el tiempo de entrega de dichos servicios, como los sintetizadores de oligonucleótidos ÄKTA de Cytiva, que se pueden comprar y operar a diario.

En el pasado, la biología molecular utilizaba secuencias cortas de ADN, como cebadores para la reacción en cadena de la polimerasa o sondas para la detección, amplificación y cambio molecular. Ahora, los científicos están buscando secuencias más largas con diferentes partes, como genomas completos con precisión hasta una sola base, que deben ensamblarse desde cero. El método de la fosforamidita no puede funcionar con secuencias tan largas porque es menos eficaz para producir ADN puro después de secuencias de oligonucleótidos de aproximadamente 200 pb.

Utilizando un método diferente, se deben unir secuencias más largas a partir de hebras más pequeñas en etapas en las que se corrigen los errores. De esta manera, los enfoques enzimáticos son más atractivos porque pueden usarse a gran escala, pueden dirigirse a grupos específicos y son buenos para el medio ambiente. Las enzimas pueden mediar en el reconocimiento de desajustes, permitiendo el recocido selectivo de hebras complementarias, reduciendo el número de pasos en cada ciclo de elongación al eliminar la necesidad de reactivos de acoplamiento y disminuyendo la dependencia de disolventes orgánicos. Las enzimas pueden promover la síntesis con o sin plantillas de ADN, mediante amplificación o síntesis de secuencias de novo.

"Esos productos químicos son increíblemente agresivos: son volátiles y cancerígenos", dijo Gariel. “Por lo general, no es conveniente tratar con ellos en el laboratorio. Diseñamos una tecnología de síntesis enzimática de ADN (EDS) a base de agua, que se vuelve increíblemente versátil y fácil de automatizar”.

Matthew Hayes, director de tecnología y cofundador de Evonetix, dice que la mayoría de los intentos de crear ADN se han centrado en reducir la tecnología. Evonetix ha adoptado un enfoque muy diferente. “Nos hemos preguntado: '¿Qué tiene de malo la síntesis de ADN?' '¿Por qué es fundamentalmente difícil producir fragmentos largos de ADN? ¿Podemos encontrar una solución que resuelva esto desde cero?'”, explicó Hayes.

“Hoy en día hay personas que pueden fabricar máquinas que producirán una pequeña cantidad de oligos de alto rendimiento y cebadores de PCR mediante síntesis basada en columnas. Pero si desea sintetizar una variedad de cantidades moleculares bajas pero un conjunto de alta diversidad, está prácticamente restringido a los proveedores de servicios”. Evonetix planea ofrecer a los usuarios instrumentos que puedan sintetizar un conjunto de oligos utilizando chips basados ​​en semiconductores (Figura 2). "También podemos ordenar a nuestra máquina que ensamble ese grupo en una plantilla de ADN bicatenario mucho más larga", dijo Hayes.

Esta no es la primera vez que llegan al mercado sintetizadores de ADN de mesa. Emily Leproust, directora ejecutiva de Twist Bioscience, recuerda cuando la gente dejó de comprar sintetizadores de ADN de mesa. "Comencé mi doctorado en síntesis de ADN en 1996 y compramos uno de los últimos sintetizadores de oligonucleótidos de escritorio descentralizados en 1998", dijo Leproust a GEN Biotechnology.

“Pertenezco a una generación que recuerda cuando la gente dejó de comprar sintetizadores de ADN. La razón por la que dejaron de hacerlo es que era más barato y más rápido enviarlo. Mucha gente ha olvidado que solíamos tener el sintetizador de ADN de mesa y que el mercado simplemente murió porque el enfoque centralizado es más rápido y más barato”.

Entre los miles de clientes de Twist, Leproust recibe cada año algunas solicitudes preguntando si los usuarios pueden tener el chip y la máquina de síntesis de ADN en su laboratorio, a lo que ella estaría dispuesta a responder. "Quizás haya algunas aplicaciones de nicho en las que esté dispuesto a pagar mucho más para que la síntesis se realice en el sitio", dijo Leproust. "Pero si es en el sitio, será mucho más costoso; nunca se superará el precio en una instalación centralizada".

Leproust dice que Twist tiene “escalabilidad ilimitada. Cuando tenía mi sintetizador de ADN de escritorio en la escuela de posgrado, podía producir ocho oligos. Ahora, las computadoras de escritorio pueden producir alrededor de 96. ¿Pero qué pasa si quieres hacer 500 oligos? Tienes que ejecutar el instrumento cinco veces seguidas. Si quieres 10.000 oligos, ¡debes ejecutarlo 100 veces seguidas! Nuestra gama es súper flexible”.

Empresas de síntesis de ADN como Twist ofrecen la posibilidad de producir rápidamente grandes y complejas cantidades de ADN a precios que finalmente se están volviendo más asequibles. La plataforma de síntesis de genes de alto rendimiento basada en silicio de Twist produce fragmentos de genes de alta calidad por tan solo 0,07 dólares por pb y secuencias genéticas clonales perfectas verificadas mediante secuenciación de próxima generación por tan solo 0,09 dólares por pb.

"Nuestra tecnología puede producir millones de oligos al mismo tiempo, hasta 300 bases con una calidad de aproximadamente un error entre 2 y 3.000 bases, y podemos ensamblar hasta 5.000 bases en una construcción", dijo. "Si desea fragmentos de 1 kb de longitud, podemos hacerlo por 70 dólares y enviárselos en cuatro días, y podemos fabricar más de 1 millón de estos fragmentos de 1000 bases al año".

Aunque Leproust cree que la tecnología de Twist puede superar los oligos de 300 bases, la síntesis de los oligos es relativamente lenta en comparación con unirlos. "Si tuviéramos que fabricar 1.000 bases mediante síntesis, no sería más rápido que lo que enviamos hoy en cuatro días y se perdería velocidad, calidad y costo", dijo Leproust. “Hay cierta vanidad al decir: 'Puedo hacer un fragmento de 1.000 pb'. Pero si es más caro, más lento y de menor calidad, eso no es lo que el cliente quiere. Nos interesa más lo que mueve la aguja para el cliente. No me gusta realizar experimentos científicos. Somos una operación de alto rendimiento, gran escala y bajo costo con un margen bruto muy bueno, y tenemos que generar un crecimiento de ingresos trimestralmente”.

Twist está trabajando en varios frentes para mejorar su síntesis de ADN como servicio. Una dimensión de la I+D de Twist es la del chip de silicio. Leproust dijo que están intentando crear una síntesis de ADN de mayor densidad. "Podemos producir un millón de oligos con el chip actual, que es del tamaño de un teléfono móvil grande o de una placa de 96 pocillos", afirmó Leproust (Figura 3). “El nuevo chip es 24 veces más pequeño, aproximadamente del tamaño de un sello postal, y podemos fabricar 256 millones de oligos con él. Eso es una mejora en cantidad y costo de más de 6000 ×. Nuestra hoja de ruta para la miniaturización y la reducción de costos es pasar de 256 millones a 3 mil millones, luego 10 mil millones y luego 50 mil millones de oligos por chip”.

La segunda dimensión se refiere a la velocidad. Actualmente, se necesitan 4 días desde que se realiza el pedido hasta que se recibe ADN sintetizado de 1000 pb en el camión de FedEx. Leproust cree que Twist probablemente pueda reducir ese tiempo a la mitad o dos días. Una tercera consideración es la longitud de los fragmentos de genes. El máximo actual de Twist es de aproximadamente 1,8 kb, pero Leproust quiere ampliarlo a 5 kb. El cuarto aspecto es la masa que el cliente necesita. Leproust dice que algunos clientes quieren femtomoles, mientras que otros pueden necesitar 100 kg. Twist se encuentra en el lado bajo de este rango, pero está trabajando para ampliar las cantidades que desean los clientes.

En un campo cada vez más saturado, la mejor manera de tomar la iniciativa en la síntesis de ADN es hacer que las cosas sean mucho mejores que el estado del arte. Por eso Michael Chen, director ejecutivo y fundador de Nuclera, decidió dar un giro. "No vimos una trayectoria en la que la síntesis enzimática de ADN diera como resultado una mejora de 10 o 100 veces en algo para el cliente".

Chen y sus cofundadores se plantearon una pregunta diferente: ¿cuál es el cuello de botella en la investigación actual? Chen sostiene que el principal obstáculo para todas las empresas en el ámbito de los EDS es en realidad fabricar las proteínas necesarias para escribir el ADN.

Formado como cristalógrafo de rayos X, "la gente a menudo me preguntaba cuál era el cuello de botella en el proceso". Dijo Chen. “La suposición natural es que se trata de la cristalografía, que me llevó entre 3 y 6 meses aprender. ¡Pero lo que me llevó años fue obtener buenas proteínas para llevar a cabo mi proyecto de doctorado! Esto se parece mucho al descubrimiento de fármacos, en el que los investigadores pasan meses, tal vez incluso años, para conseguir las proteínas objetivo. Los científicos de proteínas de hoy están en el laboratorio durante semanas realizando un proceso increíblemente laborioso para hacer crecer, manipular, romper y purificar células. Es una industria multimillonaria, por lo que es una gran oportunidad”.

Chen vio la oportunidad de aprovechar la tecnología central de microfluidos digitales de Nuclera y colaborar en una asociación estratégica con el creador de pantallas ePaper, E Ink. “La cadena de suministro y la investigación para fabricar pantallas de ePaper tienen mucho que ver con el tipo de tecnología de automatización de gotas en la que estamos trabajando y comercializando en Nuclera. Hemos creado [la tecnología eDrop lab-on-a-chip] para mover miles de gotas de forma programable en lo que llamamos un proceso de "pipetar y olvidar". El investigador pipetea directamente en el cartucho y luego puede marcharse”.

Ya sea mediante métodos de ensamblaje o de síntesis química de oligonucleótidos, la generación de ADN largo es una realidad y tiene una lista cada vez mayor de aplicaciones biotecnológicas más allá de la producción de proteínas y vida sintética. La síntesis de ADN se puede utilizar para fabricar vacunas, terapias genéticas, almacenamiento de datos de ADN, origami de ADN (Cuadro 3), nanobots6 y plantas resistentes al cambio climático. Esto ha provocado una enorme demanda de producción en masa de ADN sintético largo y, con ello, un aumento en el desarrollo y comercialización de técnicas de síntesis de ADN.

El origami de ADN consiste en utilizar oligos cortos (“grapas”) para guiar el plegado de una hebra larga (“andamio”) y permitir el ensamblaje de estructuras complejas en 2D y 3D, incluidas nanoestructuras curvas. En 2012, se utilizó origami de ADN para ensamblar nanoestructuras complejas, como canales transmembrana cerrados.9,10

Ese mismo año, se informó sobre un enfoque para el diseño de estructuras complejas de ADN en 3D basado en el ensamblaje de oligonucleótidos cortos (sin una cadena de andamiaje) denominados ladrillos de ADN.11 La clave de este enfoque radica en vincular unidades estructurales (8-meros) a ubicación física, creando de hecho una dirección de ocho nucleobases para cada posición en un espacio 3D discreto. El uso de direcciones únicas hizo posible ensamblar estructuras 3D basadas en conjuntos prediseñados de oligómeros cortos de ADN (“ladrillos”): cada bloque de ADN es de 32 unidades, diseñado como cuatro dominios contiguos de ocho bases dirigidos a direcciones físicas adyacentes, que recuerdan a un Ladrillo LEGO® 2×1.

Aunque no todas las soluciones se han lanzado al mercado, la síntesis de ADN de largo alcance es claramente posible y está mejorando en términos de precio, velocidad y calidad. Y cada vez hay más soluciones en todos los segmentos de clientes que buscan dar forma al futuro de la biotecnología utilizando ADN sintético largo.

El desarrollo de tecnologías de síntesis de ADN también puede ser relevante en la ciencia de materiales y la nanotecnología. Los ácidos nucleicos son una fuente notablemente versátil de nuevos materiales y nanodispositivos. El diseño y la evolución combinados con la resolución subangstrom que ofrecen los andamios de ácidos nucleicos pueden permitir no solo el ensamblaje de estructuras intrincadas sino también conferirles propiedades como unión estrecha de ligandos, actividad catalítica y diferentes estados conformacionales. La modificación química de los ácidos nucleicos, y en particular la sustitución total de la estructura natural por polímeros genéticos sintéticos (ácidos xenonucleicos [XNA]) capaces de evolucionar, tiene el potencial de crear estructuras y dispositivos novedosos, así como de ampliar en gran medida sus funcionalidades, por ejemplo , generando dispositivos XNA que son estables in vivo y que pueden usarse en aplicaciones de diagnóstico aprovechando la fluorescencia o las propiedades catalíticas.

El trabajo en curso para ampliar la química que es compatible con la síntesis y la evolución enzimáticas se sumará a la creciente paleta de XNA disponibles para la construcción de nanoestructuras y dispositivos XNA que permitan funciones novedosas y un rendimiento mejorado en entornos y condiciones desafiantes.

Referencias

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7. Wetterstrand KA. Costos de secuenciación de ADN: datos. 2022. [Último acceso: 1 de marzo de 2023]. Google Académico

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Este artículo se publicó originalmente en la edición de abril de 2023 de la revista GEN Biotechnology. GEN Biotechnology, publicada por Mary Ann Liebert, Inc., es una importante revista revisada por pares que publica investigaciones y perspectivas originales sobresalientes en todas las facetas de la industria biotecnológica.